(Diagnostic Reagent Grade) ASAHI KASEI ENZYMES T-194REACH適合品

PHOSPHOLIPASE A₂ [PLA₂ⅡL]

from Streptomyces violaceoruber
(Phosphatidylcholine 2–acylhydrolase, EC 3.1.1.4)

Preparation and Specification

Appearance: : Colorless to brownish solution

Specific activity: : More than 200 U/ml

Properties

Substrate specificity: : See Table 1

Molecular weight: : 15 kDa (Sephadex G–100)

Isoelectric point: : pH 7.51

Michaelis constants: : Lecithin　5.0 × 10^–3M

Optimum pH: : 7.3–8.3Figure 1

pH stability: : 6.0–9.5 (55℃, 10 min) Figure 2

Thermal stability: : Stable at 50℃ and below (pH8.0, 10 min, + CaCl₂) Figure3

Stabilizer: : Ca²⁺

Activator: : Ca²⁺, Non–ionic detergents

Inhibitor: : EDTA

Applications for Diagnostic Test

This enzyme is useful for enzymatic determination of lecithin when coupled with lysophospholipase (T–32) , glycerophosphorylcholine phosphodiesterase (T–33) and choline oxidase (T–05) .

	PLA₂ⅡL
Lecithin + H₂O	→	Lysolecithin + Fatty acid
	LYPL
Lysolecithin + H₂O	→	Glycerophosphorylcholine + Fatty acid
	GPCP
Glycerophosphorylcholine + H₂O	→	Glycerophosphate + Choline
	COD
Choline + 2 O₂ + H₂O	→	Betaine + 2 H₂O₂
	POD
2 H₂O₂ + 4-AA + Phenol	→	Quinoneimine dye + 4 H₂O

Table 1. Substrate specificity

Substrate	Relative activity (%)
Phosphatidylcholine	100
Phosphatidylethanolamine	30
Phosphatidic Acid	10
Lysophosphatidylcholine	0
Triolein	0
Trilaurin	0

Fig.1 pH Optimum

20 mM Britton-Robinson buffer

Fig.2 pH Stability

55℃, 10 min.
20 mM Britton-Robinson buffer containing 50 mM CaCl₂

Fig.3 Thermal Stability

20 mM Britton-Robinson buffer pH 8.0 for 10 min.
○: None
●: +50 mM CaCl₂

Assay

Principle

The assay is based on the increase in absorbance at 500 nm as the formation of quinoneimine dye proceeds in the following reactions:

	PLA₂ⅡL
Lecithin+H₂O	→	Lysolecithin+Fatty acid
	ACS
Fatty acid+CoA+ATP	→	Acyl–CoA+AMP+PPi
	ACOD
Acyl–CoA+O	→	2, 3–Enoyl acyl–CoA+H₂O₂
	POD
2 H₂O₂+4–AA+Phenol	→	Quinoneimine dye+4 H₂O

ACS:Acyl–CoA synthetase
ACOD: Acyl–CoA oxidase
ATP: Adenosine triphosphate

Unit definition

One unit is defined as the amount of enzyme which liberates 1 μmole of fatty acid per minute at 37℃ under the conditions specified in the assay procedure.

Reagents

Reaction mixture for the first reaction

0.2 M Tris–HCl buffer　pH 8.0	0.20 ml
20 mM DPPC solution ¹⁾	0.05 ml
1 M CaCl₂ solution	0.025 ml
0.2 M ATP solution　pH 7.0	0.01 ml
0.1 M CoA solution　pH 6.0 ²⁾	0.02 ml
10.6 U/ml ACS solution ³⁾	0.05 ml

Distilled water

0.145 ml

1) :	20 mM DPPC solution Dissolve 147 mg of DPPC with 10 ml of 2% (W/V) Triton X–100 solution.
2) :	0.1 M CoA solution pH 6.0 Dissolve 7.85 g (purity calculation) of CoA with 80 ml of distilled water and adjust pH to 6.0 (25℃) with 4 N NaOH and add distilled water to make a total of 100ml.
3) :	10.6 U/ml ACS solution Dissolve 106 U of ACS with 10 ml of Tris–HCl buffer pH 8.0.

DDPC:

Dipalmytoylphosphatidylcholine

Reaction mixture for the second reaction

0.5 M PIPES–NaOH buffer pH 7.5	0.04ml
0.3% (W/V) 4–AA solution	0.10ml
0.2% Phenol solution	0.10ml
50 U/ml POD solution⁴⁾	0.045ml
300 U/ml ACOD solution⁵⁾	0.05ml
10% (W/V) Triton X–100 solution	0.01ml
0.2 M ATP solution pH 7.0	0.05ml
10 mM FAD solution	0.005ml
Distilled water	0.10ml

4) :	50 U/ml POD solution Dissolve 500 U (PPU) of POD with 10 ml of distilled water.
5) :	300 U/ml ACOD solution Dissolve 3,000 U of ACOD with 10 ml of PIPES–NaOH buffer pH 7.5.

FAD:	Flavine adenine dinucleotide

20 mM NEM
NEM: N–ethylmaleimide
Reaction stopper
0.1 M EDTA solution containing 0.5% (W/V) SDS pH8.0

SDS: Sodium dodecyl sulfate

EDTA: Ethylenediamine tetraacetic acid
Enzyme dilution buffer
10 mM Tris–HCl buffer pH 8.0 containing 0.05% (W/V) BSA.
Reagents:
DPPC: Nippon Fine Chemical Co., Ltd.
Coenzyme A (CoA・Li₃) : Kohjin Co.
ATP (2Na・3H₂O) : Kyowa Hakko Co., Ltd.
PIPES［Piparazine–1,4–bis (2–ethanesulphonic acid) ］:

Dojindo Laboratories #345–02225
Triton X–100: The Dow Chemical Company
NEM: FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

#058–02061
ACS: Asahi Kasei Pharma Corporation #T–16
ACOD: Asahi Kasei Pharma Corporation #T–17
SDS: NACALAI TESQUE, INC. #316–06
4–AA: NACALAI TESQUE, INC.　Special grade

#01907–52
POD: Sigma Chemical Co. Type Ⅱ #P–8250
EDTA (2Na・2H₂O) : KISHIDA CHEMICAL Co., Ltd.

#060–29133

Enzyme solution

Dilute accurately 0.5 ml of the sample with enzyme dilution buffer to make a 50-fold Solution. Dilute it with enzyme dilution buffer to adjust the concentration as required.

Procedure

Pipette accurately 0.50 ml of reaction mixture for the first reaction into a small test tube and preincubate at 37℃.
After 5 min, add exactly 50 μl of enzyme sample and mix to start the first reaction at 37℃.

※ In the case of a test blank, add 50 μ1 of enzyme dilution buffer in place of enzyme solution at this point.

After 10 min, add 0.5 ml of 20 mM NEM and add 0.5ml of reaction mixture for the second reaction after 15 seconds later and mix to start the second reaction at 37℃.
At 5 min after starting the reaction, add 1.5 ml of the reaction stopper to stop the reaction.
Measure the absorbance at 500 nm.

Absorbance sample : As

blank : Ab

△A = (As−Ab) ≦ 0.20 Abs

Calculation

Activity (U/mg) = {(△A/10)/(12.0×1/2)} × 3.05/0.05 × D

12.0 :	millimolar extinction coefficient of quinoneimine dye at 500 nm (cm²/μmole)
1/2 :	a multiplier derived from the fact that 2 mole of H₂O₂ produces 1 mole of quinoeimine dye
10 :	reaction time (min)
3.05 :	final volume (ml)
0.05 :	volume of enzyme solution (ml)
D :	times of dilution in enzyme solution

Storage

Storage at 2～8℃ in the presence of a desiccant is recommended.

References

Scandella, C. J. and Kornberg, A. C. (1971) Biochemistry, 10, 4447–4456.
Nishijima, M., Akamatsu, Y. and Nojima, S. (1974) J. Biol. Chem., 249, 5658–5667.
Waite, M. and Sisson, P. (1971) Biochemistry, 10, 2377–2383.
Kannagi, R. and Koizumi, K. (1979) Biochim. Biophys.
Acta, 556, 423–433.
Van Dam–Mieras, M. C. E., Slotboom, A. J., Pieterson,
W. A. and de Haas, G. H. (1975) Biochemistry, 14, 5387–5393.

PLA₂ⅡL活性測定法 (Japanese)

試薬液

第一反応試薬混合液

0.2M トリス–HCl 緩衝液 pH8.0	0.20 ml
20mM DPPC 溶液¹⁾	0.05 ml
1M 塩化カルシウム溶液	0.025 ml
0.2M ATP 溶液 pH7.0	0.01 ml
0.1M CoA 溶液 pH6.0²⁾	0.02 ml
10.6U/ml ACS 溶液³⁾	0.05 ml
精製水	0.145 ml

1) ：	20mM DPPC 溶液 DPPC 147mg を2% (W/V) トリトンX–100 溶液10ml で溶解する。

2) ：	0.1M CoA 溶液 pH6.0 CoA 7.85g (純度換算) を精製水80ml に溶解した後、4N NaOH でpH6.0 (25℃) に調整し、精製水で全容100ml とする。
3) ：	10.6U/ml ACS 溶液 ACS 106 単位 (U) を10mM トリス−HCl 緩衝液pH8.0 10ml で溶解する。

第二反応試薬混合液

0.5M PIPES–NaOH 緩衝液 pH7.5	0.04 ml
0.3% (W/V) 4–AA 溶液	0.10 ml
0.2% (W/V) フェノール液	0.10 ml
50U/ml POD 溶液⁴⁾	0.045 ml
300U/ml ACOD 溶液⁵⁾	0.05 ml
10% (W/V) トリトンX–100 溶液	0.01 ml

0.2M ATP 溶液 pH7.0 0.05 ml

10mM FAD 溶液 0.005 ml

精製水 0.10 ml

4) ： 50U/ml POD 溶液
POD 500 単位 (PPU) を精製水10ml で溶解する。

5) ： 300U/ml ACOD 溶液
ACOD 3,000 単位 (U) を10mM PIPES–NaOH
緩衝液pH7.5 10ml で溶解する。
20mM NEM 溶液
反応停止液
0.5% (W/V) SDS を含む0.1M EDTA 溶液 pH8.0
酵素溶解希釈用液
0.05% (W/V) BSA を含む10mM トリス−HCl 緩衝液pH8.0
試薬
DPPC (ジパルミトイルフォスファチジルコリン)
：日本精化製
CoA (コエンザイム・Li₃) ：興人製
ATP (アデノシン三リン酸・2Na・3H₂O) ：
協和発酵製
PIPES［ピペラジン–1,4– ビス (2– エタンスルホン酸) ］：

同仁化学製　#345–02225
トリトンX–100：Dow chemical 製
FAD (フラビンアデニンジヌクレオチド・2Na) ：
協和発酵製
NEM (N– エチルマレイミド) ：

富士フイルム和光純薬製　特級　#058–02061
ACS：旭化成ファーマ製　#T–16
ACOD：旭化成ファーマ製　#T–17
SDS (ドデシル硫酸ナトリウム) ：
ナカライテスク製　#316–06
4–AA：ナカライテスク製　特級　#01907–52
POD: シグマ製　Type Ⅱ　#P–8250
EDTA (エチレンジアミン四酢酸・2Na・2H2O) ：
キシダ化学製 #060–29133

酵素試料液

検品0.5ml を酵素溶解希釈用液で50 倍に希釈する。

その液を酵素溶解希釈用液で適宜希釈する。

測定操作法

小試験管に第一反応試薬混合液0.50ml を正確に分注し37℃で予備加温する。
5 分経過後、酵素試料液50 μl を正確に加えて混和し、37℃で第一反応を開始する。

※ 盲検は酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈緩衝液50 μl を加える。
10 分経過後、20mM NEM 溶液0.50ml を加えて混和し、15 秒後に第二反応試薬混合液0.50ml を加えて混和し、37℃で第二反応を開始する。
5 分経過後、反応停止液1.50ml を加えて混和し、反応を停止する。
500nm における吸光度を測定する。
求められた吸光度を試料液はAs、盲検液はAb とする。
ΔA = (As−Ab) ≦ 0.20 Abs.

計算

活性 (U/mg) = {(△A/10)/(12.0×1/2)} × 3.05/0.05 × D

12.0 :	キノンイミン色素の500nm におけるミリモル分子吸光係数 (cm² / μmole)
1/2 :	H₂O₂ 2 モルからキノンイミン色素1 モルが生成することによる係数
10 :	反応時間 (min)
3.05 :	反応総液量 (ml)
0.05 :	反応に供した酵素試料液量 (ml)
D :	酵素試料液の調製希釈倍数

SDS:	Sodium dodecyl sulfate
EDTA:	Ethylenediamine tetraacetic acid

0.2M ATP 溶液 pH7.0	0.05 ml
10mM FAD 溶液	0.005 ml
精製水	0.10 ml

4) ：	50U/ml POD 溶液 POD 500 単位 (PPU) を精製水10ml で溶解する。
5) ：	300U/ml ACOD 溶液 ACOD 3,000 単位 (U) を10mM PIPES–NaOH 緩衝液pH7.5 10ml で溶解する。

Absorbance sample :	As
blank :	Ab

PHOSPHOLIPASE A2 [PLA2ⅡL] (T-194)

PHOSPHOLIPASE A2 [PLA2ⅡL]

from Streptomyces violaceoruber (Phosphatidylcholine 2–acylhydrolase, EC 3.1.1.4)