(Diagnostic Reagent Grade) ASAHI KASEI ENZYMES T-58REACH compliant product

3α–HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE [3α–HSDⅡ]

from Pseudomonas sp.
（3 α –Hydroxysteroid: NAD⁺ oxidoreductase, EC 1.1.1.50）

Preparation and Specification

Appearance: : White amorphous powder, lyophilized

Specific activity: : More than 30 U/mg solid

Properties

Substrate specificity: : See Table 1

Molecular weight: : 41 kDa（gel filtration）

Isoelectric point: : pH 4.8±0.2

Michaelis constants: : Androsterone 2.1 × l0^-4M

Optimum pH: : 8.0–10.0Figure 1

pH stability: : 6.0–10.0（37℃, 10 min）Figure 2

Optimum temperature: : 50℃（Phosphate buffer） Figure 3

Thermal stability: : Stable at 50℃ and below（pH 8.0, 10 min）Figure 4

Effect of metal ions: : See Table 2

Effect of detergents: : See Table 3

Inhibitor: : MnCl₂

Applications for Diagnostic Test

This enzyme is useful for enzymatic cycling determination of bile acid when coupled with thio–NAD and NADH.

Table 1. Substrate specificity

Substrate （0.95mM）	Relative activity （%）
Cholic acid	100
Androsterone	131
Deoxycholic acid	115
Chenodeoxycholic acid	89.0
Glycocholic acid	103
Taurocholic acid	99.0
Taurodeoxycholic acid	128

Table 2. Effect of metal ions on 3α–HSDⅡ activity

Metal ion	Relative activity （%）
None	100
NaCl	105
KCl	102
LiCl	101
MgCl₂	106
MnCl₂	16.0
CaCl₂	105

Table 3. Effect of detergents on 3α–HSDⅡ activity

Detergent	Relative activity （%）
None	100
Triton X–100	71.0
Triton X–305	71.0
Triton X–114	71.0
Adekanol SO–120	104
Adekanol NP–720	75.0
Adekanol B–795	78.0
Emulgen B–66	75.0
Emulgen 911	76.0
Emulgen 709	84.0
Emulgen 810	50.0
Emulgen 109P	112
Rheodol 460	71.0
Rheodol TWL–103	72.0

Fig.1 pH Optimum

〇: 3,3-Dimethylglutarate-NaOH
buffer
●: Phosphate buffer
□: Tris-HCI buffer
■: Glycine-NaOH buffer

Fig.2 pH Stability

37℃, 10min
〇: Acetate buffer
●: Phosphate buffer
□: Tris-HCI buffer
■: Glycine-NaOH buffer

Fig.3 Optimum Temperature

pH 8.0
20 mM Phosphate buffer

Fig.4 Thermal Stability

pH 8.0, 10 min.
20 mM Phosphate buffer

Assay

Principle

The assay is based on the increase in absorbance at 550 nm as formazan dye is formed in the following reactions:

3α–HSD Ⅱ
Cholic acid+NAD⁺	→	3–Oxocholic acid+NADH+H⁺

DI
NADH+H⁺+NTB	→	NAD⁺+NTBH₂

NAD : Nicotineamido adenine dinucleotide,
NTB : Nitrotetrazolium blue
DI : Diaphorase

Unit definition

One unit is defined as the amount of enzyme which oxidizes 1 μmole of cholic acid to 3–oxocholic acid per minute at 37℃ under the conditions specified in the assay procedure.

Reagents

Reaction mixture

10 mM NAD solution	0.05 ml
0.25%（W/V）NTB solution	0.05 ml
100 U/ml DI solution	0.025 ml
2%（W/V）Triton X–100 solution	0.10 ml
0.2 M Tris–HCl buffer pH 8.0	0.10 ml
Distilled water	0.175 ml

1）:	100 U/ml DI solution Dissolve 100 U of DI with 1 ml of 10 mM Tris–HCl buffer pH 8.0.

Substrate solution（20 mM Androsterone）
Dissolve 23 mg of androsterone with 4 ml of methanol.
Reaction stopper
0.5%（W/V）Sodiumdodecyl sulfate（SDS）solution
Enzyme dilution buffer
10 mM Tris–HCl buffer　pH 8.0
Reagents
NAD: NACALAI TESQUE, INC.　#24334–84

NTB: Dojindo Laboratories　#344–02033
DI: Asahi Kasei Pharma Corporation　#T–06
Triton X–100: The Dow Chemical Company
Androsterone: Sigma Chemical Co. #A–9755
SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）:

NACALAI TESQUE, INC. Extra pure #31606–75

Enzyme solution

Accurately weigh about 20 mg of the sample and add enzyme dilution buffer to make a total of 20 ml. Dilute it with enzyme dilution buffer to adjust the concentration as required.

Procedure

Pipette accurately 0.5 ml of reaction mixture into a
small test tube, then add 20 μl of enzyme solution into the same test tube and preincubate at 37℃.

※ In the case of a test blank, add 20 μl of enzyme dilution buffer in place of enzyme solution.
After 5 min, add exactly 25 μl of substrate solution and mix to start the reaction at 37℃.
At 5 min after starting the reaction, add 2.5 ml of the reaction stopper to stop the reaction.
Measure the absorbance at 550 nm.

Absorbance sample : As

blank : Ab

△A =（As−Ab）≦ 0.20 Abs

Calculation

Activity（U/mg of powder）= {(△A/5)/(16.7)} × 3.045/0.02 × 1/x

16.7 :	millimolar extinction coefficient of NTBH₂ at 550 nm（cm²/ μmole）
5 :	reaction time（min）
3.045 :	final volume（ml）
0.02 :	volume of enzyme solution（ml）
X :	concentration of the sample in enzyme solution （ mg/ml）

Storage

Storage at −20℃ in the presence of a desiccant is recommended.

References

Suzuki, K. and Tamaoki, B.（1974）J. Steroid Biochem., 5,
249–256.
Inano, H., Hayashi, S. and Tamaoki, B.（1977）J. Steroid Biochem., 8, 41–46.
Shikita, M. and Talalay, P.（1979）Anal. Biochem., 92, 286–292.
Uwajima, T., Takayama, K. and Terada, O.（1978）Agric.
Biol. Chem., 42, 1577–1583.
Talalay, P.（1962）Methods Enzymol., 5, 512.
Mowszowicz, I. and Bardin, C. W.（1974）Steroids, 23, 793–807.
Nimrod, A., Lamprecht, S. A. and Lindner, R. H.（1975）J. Steroid Biochem., 6, 1205–1209.
Nozu, K., Inano, H. and Tamaoki, B.（1974）Proteins Nucleic Acids and Enzymes（Japan）, 19, 397–410.

3α–HSD Ⅱ活性測定法（Japanese）

試薬液

反応試薬混合液

10mM NAD 溶液	0.05 ml
0.25%（W/V）NTB 溶液	0.05 ml
100U/ml DI 溶液1）	0.025 ml
2%（W/V）トリトンX–100 溶液	0.10 ml
0.2M トリス−HCl 緩衝液pH8.0	0.10 ml
精製水	0.175 ml

1）：	100U/ml DI 溶液 DI 100 単位（U）を10mM トリス−HCl 緩衝液 pH8.0 1ml で溶解する。

基質溶液（20mM アンドロステロン溶液）
アンドロステロン23mg をMeOH4ml で溶解する。
反応停止液
0.5%（W/V）SDS 溶液
酵素溶解希釈用液
10mM トリス−HCl 緩衝液pH8.0
試薬
NAD（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）：
ナカライテスク製　#24334–84
NTB（ニトロテトラゾリウムブルー）：
同仁化学製　#344–02033
DI（ジアフォラーゼ）：旭化成ファーマ製　#T–06
トリトンX–100：Dow Chemical 製
アンドロステロン：シグマ製　#A–9755
SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）：
ナカライテスク製　一級　#31606–75

酵素試料液

検品約20mg を精密に量り、酵素溶解希釈用液で溶解して全容20ml とする。
その液を酵素溶解希釈用液で適宜希釈する。

測定操作法

小試験管に反応試薬混合液0.5ml を正確に分注し、後に酵素試料液20 μl を正確に分注して37℃で予備加温する。

※ 盲検は酵素試料液の代わりに酵素溶解希釈用液20μl を加える。
5 分経過後、基質溶液25 μl を正確に加えて混和し、37℃で反応を開始する。
5 分経過後、反応停止液2.50ml を正確に加えて混和し、反応を停止する。
550nm における吸光度を測定する。
求められた吸光度を試料液はAs、盲検液はAb とする。
ΔA =（ As−Ab） ≦ 0.20 Abs

計算

活性（U/mg）= {(ΔA/5)/(16.7)} × 3.045/0.02 × 1/x

16.7 :	NTBH₂ の550nm におけるミリモル分子吸光係数（cm² / μmole）
5 :	反応時間（min）
3.045 :	反応総液量（ml）
0.02 :	反応に供した酵素試料液量（ml）
X :	酵素試料液中の検品濃度（mg/ml）

Absorbance sample :	As
blank :	Ab

3α–HYDROXYSTEROID DEHYDROGENASE [3α–HSDⅡ] (T-58)